Chương 5 · công cụ cốt lõi
Đây là bộ đồ nghề cho phép ta cắt một gene ra, dán nó vào một vật mang, đưa vào tế bào, rồi chọn đúng những tế bào mang gene mình cần. Nhờ nó mà vi khuẩn làm được insulin người.
Trọng tâm: quy trình 5 bước và chọn lọc xanh-trắng. Chính kỹ thuật này bạn đã làm tay ở môn Thí nghiệm Genomic (biến nạp plasmid vào vi khuẩn).
DNA tái tổ hợp (rDNA) là ghép DNA từ các nguồn khác nhau (ví dụ gene người + plasmid vi khuẩn) thành một phân tử mới. Toàn bộ kỹ thuật dựa trên hai thứ mượn từ chính vi khuẩn:
Vì nếu cắt cả gene lẫn vector bằng cùng một enzyme, hai mép thừa (overhang) sẽ bổ sung nhau → tự khớp lại đúng chiều như hai mảnh ghép, rồi ligase chỉ việc dán. Đầu bằng thì không có mép dẫn hướng nên khó ghép đúng hơn.
Tên RE kể nguồn gốc: ví dụ EcoRV = E (chi Escherichia) · co (loài coli) · R (chủng) · V (enzyme thứ năm tìm được). Hai loại vector: cloning vector chỉ để nhân bản/nghiên cứu đoạn DNA; expression vector còn mang thêm promoter mạnh và tín hiệu dịch mã để vi khuẩn sản xuất protein từ gene chèn vào.
Năm bước: (1) chuẩn bị gene cần chèn (insert) và vector — với gene của sinh vật nhân thực, dùng cDNA để bỏ intron; (2) cắt cả hai bằng cùng một enzyme (để đầu dính khớp nhau); (3) nối bằng ligase → được rDNA; (4) biến nạp vào vi khuẩn; (5) chọn lọc ra dòng mang đúng gene.
Bước chọn lọc là chỗ hay hỏi nhất. Vấn đề: sau khi biến nạp, không phải vi khuẩn nào cũng nhận đúng vector có gene chèn. Mẹo chọn lọc xanh–trắng: vector mang sẵn gene lacZ tạo màu, và chỗ chèn gene nằm giữa lacZ. Nếu vi khuẩn nhận vector rỗng (không gene chèn), lacZ còn nguyên → tạo khuẩn lạc màu xanh. Nếu nhận vector có gene chèn, gene chèn làm hỏng lacZ → khuẩn lạc màu trắng.
Lấy khuẩn lạc trắng — “trắng = trúng”. Trắng nghĩa là gene chèn đã làm hỏng lacZ → tức vi khuẩn đó mang đúng vector có gene. Khuẩn lạc xanh là vector rỗng (không có gene chèn). (Lưu ý: gene kháng kháng sinh chỉ cho biết vi khuẩn có vector, chưa chắc có gene chèn; nên cần thêm bước xanh–trắng.)
Để vi khuẩn chịu “nuốt” plasmid, nó phải ở trạng thái khả nạp (competent). Trong phòng lab, ta tạo trạng thái này bằng xử lý hóa chất rồi sốc nhiệt ~42°C (hoặc dùng xung điện) — đúng thao tác bạn làm với vi khuẩn DH5α ở môn Thí nghiệm Genomic. Sau khi có khuẩn lạc trắng, người ta còn xác nhận lần cuối bằng PCR, cắt bằng RE, hoặc giải trình tự để chắc chắn đúng gene.
Bấm 🔊 để nghe phát âm trên YouGlish.
| English | Tiếng Việt / giải thích |
|---|---|
| Recombinant DNA (rDNA) | DNA tái tổ hợp |
| Restriction enzyme (RE) | Enzyme cắt giới hạn (cái kéo) |
| Palindromic | Đối xứng xuôi-ngược |
| Sticky / Blunt ends | Đầu dính / đầu bằng |
| Plasmid / Vector | Plasmid / vector mang DNA (xe chở) |
| Multiple cloning site (MCS) | Vùng cắt đa điểm (chỗ chèn gene) |
| Cloning / Expression vector | Vector tạo dòng / biểu hiện |
| Transformation | Biến nạp (đưa DNA vào tế bào) |
| Competent cell | Tế bào khả nạp |
| Blue-white selection (lacZ) | Chọn lọc xanh-trắng (trắng = có insert) |