Chương 3
Biết một gene tồn tại là một chuyện; biết nó đang hoạt động mạnh hay yếu lại là chuyện khác — và thường quan trọng hơn. Chương này là bộ công cụ để đo điều đó, từ một gene tới cả hệ phiên mã.
Đề hay cho bài tập thiết kế mồi và tính Tm — ta sẽ hiểu công thức chứ không học vẹt. Liên hệ SHPT Ch.7 (PCR, điện di đã gặp); ở đây đào sâu công thức và thêm qPCR, microarray.
Nhắc lại từ SHPT: PCR nhân một đoạn DNA thành hàng triệu bản (Mullis, Nobel 1993). Thành phần: khuôn, một cặp mồi xuôi/ngược (F/R) để định ranh giới đoạn cần nhân, nguyên liệu dNTP, enzyme Taq chịu nhiệt, và dung dịch đệm. Ba bước mỗi chu kỳ: biến tính ~95°C → bắt cặp mồi ~50–60°C → kéo dài ~72°C; sau n chu kỳ được ~2ⁿ bản.
Điểm mới ở môn này là chọn mồi sao cho đúng. Mồi phải bám vào khuôn ở nhiệt độ vừa phải; nhiệt độ đó ước lượng bằng một công thức đơn giản dựa trên thành phần base của mồi:
Để ý: mỗi G hoặc C đóng góp 4°C, còn mỗi A hoặc T chỉ 2°C — đúng vì G–C có 3 liên kết hydro, bám chặt hơn (nhắc lại SHPT Ch.2). Nhiệt độ bắt cặp mồi (Ta) lấy thấp hơn Tm khoảng 5°C.
Tm = 2×(A+T) + 4×(G+C) = 2×4 + 4×6 = 8 + 24 = 32°C. (Mồi thật thường dài 18–30 nu để Tm rơi vào khoảng 55–65°C.) Nhớ: G–C “nặng ký” gấp đôi A–T trong phép tính này.
Đệm có gì: Tris giữ pH ổn định; MgCl₂ là cofactor không thể thiếu của polymerase; KCl trung hòa điện tích khung phosphate để mồi bám tốt. Chọn enzyme: Taq chạy nhanh nhưng không đọc-sửa (dễ sai); khi cần độ chính xác cao (ví dụ để tạo dòng) người ta dùng Pfu (có đọc-sửa). Năm tiêu chí thiết kế mồi: dài 18–30 nu; Tm 55–65°C (quan trọng nhất, và hai mồi phải gần bằng nhau); GC 40–60%, nên kết thúc bằng G hoặc C ở đầu 3′; tránh ≥4 base giống nhau liên tiếp; tránh lặp dinucleotide.
Muốn biết một gene đang hoạt động mạnh hay yếu thì phải đo lượng mRNA của nó (biểu hiện gene ≈ lượng mRNA). Nhưng PCR chỉ chạy trên DNA, nên bước đầu phải đổi RNA thành DNA: đó là RT-PCR — dùng enzyme reverse transcriptase chép RNA thành cDNA (dùng mồi oligo-dT câu vào đuôi poly-A của mRNA), rồi mới PCR.
Còn muốn biết bao nhiêu bản ban đầu thì dùng qPCR (PCR định lượng thời gian thực): máy đo lượng DNA ngay trong lúc khuếch đại bằng tín hiệu huỳnh quang. Chỉ số quan trọng là Ct (chu kỳ ngưỡng), với một quy tắc dễ nhớ: Ct thấp = nhiều DNA ban đầu (vì đông quân từ đầu thì sớm chạm ngưỡng).
Mẫu A (Ct thấp hơn). Ct thấp nghĩa là chỉ sau ít chu kỳ đã đủ nhiều để vượt ngưỡng → xuất phát đã đông. Đây là cách đo tải lượng virus (HIV, SARS-CoV-2): tải lượng cao → Ct thấp.
Vì sao phải đổi RNA thành cDNA trước: RNA kém bền, một sợi, dễ bị enzyme RNase phân hủy; cDNA thì bền và mạch đôi, xử lý an toàn hơn. Tín hiệu huỳnh quang trong qPCR đến từ chất xen vào dsDNA (như SYBR Green) hoặc từ probe chuyên biệt. Có thể định lượng tuyệt đối (so với đường chuẩn → ra số bản) hoặc tương đối (so với một gene tham chiếu).
PCR/qPCR đo một vài gene mỗi lần. Microarray (chip DNA) làm điều tham vọng hơn: đo gần như mọi gene (~23.000) trong một lần — bằng cách gắn hàng nghìn đầu dò lên một con chip, cho cDNA của mẫu (đã đánh dấu huỳnh quang) lai vào, rồi đọc độ sáng từng điểm. So sánh hai mẫu (ví dụ mô bệnh vs mô lành, nhuộm hai màu đỏ/xanh) bằng một chỉ số:
M > 0: gene mạnh hơn ở mẫu đỏ; M = 0: như nhau; M < 0: mạnh hơn ở mẫu xanh. Toàn bộ RNA trong tế bào tại một thời điểm gọi là transcriptome — và nó động (thay đổi theo lúc, theo loại tế bào), khác với bộ gen vốn cố định.
Transcriptome nối genome cố định với proteome (bộ protein đang có). Cùng một genome, nhưng transcriptome của tế bào gan khác hẳn tế bào thần kinh — đó chính là chuyên hóa tế bào, nhìn ở cấp RNA. Ngoài microarray, công cụ mạnh hơn là RNA-seq (giải trình tự RNA, Ch.4) — đọc được cả những mRNA chưa biết trước và định lượng chính xác hơn, nên nay được coi là chuẩn vàng.
Bấm 🔊 để nghe phát âm trên YouGlish.
| English | Tiếng Việt / giải thích |
|---|---|
| Forward / Reverse primer | Mồi xuôi / mồi ngược |
| Melting temperature (Tm) | Nhiệt độ nóng chảy mồi |
| Proofreading / High-fidelity | Đọc-sửa (Pfu, Vent) |
| RT-PCR / Reverse transcriptase | PCR phiên mã ngược (từ RNA) |
| cDNA / Oligo-dT | DNA bổ sung từ RNA / mồi bắt poly-A |
| Real-time qPCR | PCR định lượng thời gian thực |
| Ct (threshold cycle) | Chu kỳ ngưỡng (thấp = nhiều DNA) |
| DNA microarray | Chip đo mọi gene cùng lúc |
| Transcriptome / Transcriptomics | Hệ phiên mã / hệ phiên mã học |
| RNA-seq | Giải trình tự RNA (chuẩn vàng) |